ACP核酸检测试剂盒说明书

本试剂盒选取一对鹦鹉热衣原体(ACP)特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取DNA，后者在耐热DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对鹦鹉热衣原体(ACP)一段高保守区域进行扩增，从而达到快速实时定量检测之目的。

核酸提取液B    4管    500μl/管 ,Taq 酶系    1管    80μl/管 ,ACP–PCR MIX    1管    960μl/管  ,ACP 阳性质控品    1管    50μl/管(1×10P7PCopies/ml) 
阴性质控品    1管    500μl/管

C-33A细胞，C8166细胞，C918细胞  适用标本：疑似患者痰液或灌洗液及咽试子等和疑似动物(鸟类及牛羊等哺乳类)肺脏、淋巴结等组织。
标本采集：
痰液：取受检者深部痰液2-3ml置入5ml离心管，密闭送检。
灌洗液：取待检者肺灌洗2-3ml，置于5ml离心管，密闭送检。
咽试子：受检者生理盐水漱口，无菌咽试子粘取深部痰液，置入5ml离心管，密闭送检。
疑似动物组织：取发病动物肺脏、淋巴结等组织1g左右，转至一1.5ml 离心管中，密闭送检。

使用方法
DNA提取
C-33A细胞，C8166细胞，C918细胞  标本预处理
痰液或灌洗液：将痰液或灌洗液充分混匀，取0.5ml转至1.5ml干净离心管，加入等体积4%NaOH，充分混匀，室温放置10min，13,000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀。咽试子：取1ml生理盐水加入5ml离心管，充分洗涤咽试子，将洗涤液转至1.5ml干净离心管中，13,000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀。组织：取约100mg组织加1ml生理盐水，研磨成组织匀浆，取50μl匀浆液转至一洁净的1.5ml离心管中。
DNA提取：向上述标本中加入50μl核酸提取液B充分混匀，100℃烈解10min。13,000rpm 离心3min，取上清液4μl做PCR反应。C-33A细胞，C8166细胞，C918细胞 

阴性质控品：取50 μl阴性质控品加入50μl核酸提取液B，充分震荡。后100℃裂解10分钟，然后13,000rpm离心3分钟，取上清液4μl做PCR反应。
ACP-阳性质控品：直接取4μl进行PCR扩增。或按照PCR扩增介绍方法进行定量分析。
PCR扩增
从试剂盒中取出ACP–PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂    ACP–PCR MIX    Taq酶系
用量    24μl    2μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品(所获得的DNA样品)或ACP–阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置反应体积(30μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件：
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器：循环条件：94→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。
LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：94→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。
3．结果分析判定
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的标准曲线达到*（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty-Copies/ml）。

1301细胞，22Rv1细胞，293细胞，293Ad5细胞，293 Cells细胞，293T细胞，293T/17细胞，2BS细胞，5637（HTB-9）细胞，6T-CEM细胞，769-P细胞，786-O细胞，95-D细胞，A172细胞，A-204细胞，A2780细胞，A3细胞，A-375细胞，A-427细胞，A-431细胞，A498细胞，A549细胞，A-673细胞，A875 LIFE细胞，AAV-293细胞，ACC-2细胞，ACC-3细胞，ACHN细胞，AE1201细胞，AGS细胞，AN3CA细胞，Anglne细胞，AsPC-1细胞，Bcap-37细胞，BE(2)-M17细胞，BEAS-2B细胞，BEL-7402细胞，BEL-7404细胞，BEL-7405细胞，BeWo细胞，BGC-823细胞，BIU-87细胞，BT-325细胞，BT-474细胞，BT-549细胞，BxPC-3细胞，，Ca Ski细胞，CA46细胞，Caco-2细胞，Caki-1细胞，Calu-3细胞，Calu-6细胞，Caov-3细胞，CCC-ESF-1细胞，CCC-HB-2细胞，CCC-HBE-2细胞，CCC-HEH-细胞，CCC-HEK-1细胞，CCC-HIE-2细胞，CCC-HPE-2细胞，CCC-HPF-1细胞，CCC-HSM-2细胞，CCD-1095Sk细胞，CCRF-CEM细胞，CFPAC-1细胞，CGM1细胞，Chang liver细胞，CNE细胞，CNE-2Z细胞，CNLMG-B5537LC细胞，CNLMG-B5537SKIN细胞

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