肺炎支原体（MHP）核酸扩增检测试剂盒

肺炎支原体(MHP)核酸扩增检测试剂盒

试剂盒选取一对肺炎支原体(MHP)特异性引物和一条特异性荧光探针，应用碱裂解法提取肺炎支原体(MHP)DNA，后者在耐热DNA聚合酶（Taq酶）作用下，配以FQ-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR-荧光探针体外扩增法对肺炎支原体(MHP)进行扩增，从而达到快速检测定量之目的。

标本采集、保存和运输
1.适用标本：发病动物（猪、牛、羊等）呼吸道分泌物或尸检动物肺、淋巴结等组织标本等。
2.标本采集：
呼吸道分泌物：用无菌棉试子深擦疑似动物的喉头或鼻腔，采集呼吸道分泌物，后转至一盛有1-3ml生理盐水(或PBS)的5ml离心管中，密闭送检。
肺、淋巴结等固体组织：无菌条件下采取具有特征的肺脏或淋巴结等组织500mg，转至一洁净的1.5ml离心管中，密闭送检。
3.保存和运输：述处理后的标本可保存于-20℃，保存期为6个月，-70℃可长期保存。运送应采用0℃冰壶。

2PCR扩增
从试剂盒中取出MHP–PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
试剂    MHP–PCR MIX    Taq酶系
用量    24μl    2μl
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品(所获得的DNA样品)或MHP–阳性定量标准品(使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置反应体积(30μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件：
ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器：循环条件：94→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。

使用方法
1DNA提取
1.1标本预处理
1.1.1呼吸道分泌物：将标本充分混匀，挤干棉试子，取1ml试子液转至1.5ml干净离心管， 13,000rpm离心5分钟，弃上清，保留沉淀。
1.1.2肺脏、淋巴结等固体组织：取200mg组织加入1ml生理盐水，采用液氮或研磨器充分研磨成组织匀浆，取50μl匀浆液，转至一洁净的1.5ml干净离心管中。
1.1.3阴性质控品：取50μl阴性质控品转至1.5ml干净离心管。
1.2 DNA提取：向上述标本中加入50μl核酸提取液B充分混匀，100℃烈解10min。13,000rpm 离心3min，取上清液4μl做PCR反应。
阴性质控品：取50 μl阴性质控品加入50μl核酸提取液B，充分震荡。后100℃裂解10分钟，然后13,000rpm离心3分钟，取上清液4μl做PCR反应。
MHP阳性质控品：直接取4μl进行PCR扩增。或按照PCR扩增介绍方法进行定量分析。
LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：94→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。
3．结果分析判定
反应结束后保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（3~8），stop值（13~18）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的标准曲线达到*（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值），zui后到Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（Qty-Copies/ml）。
质控标准
阴性质控品：全部阴性。
MHP阳性质控品：阳性质控品的 Ct 值均应小于 35.0。
∣r∣≥0.97（correlation数值介于-0.97~-1之间，correlation数值等同于∣r∣值）。
 以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。
结果判定
测定结果的计算：
如果Ct值﹤38，则实验样品的MHP DNA含量(基因拷贝数/ml)= Qty-Copies/ml。
如果38﹤Ct值﹤40,为灰区建议重新检测，重新检测若38﹤Ct值﹤40判为阳性，否则为阴性。
如果Ct值=40，则MHP DNA含量（基因拷贝数/ml）﹤1×10P2PCopies/ml (低于检测下限)。

人非小细胞肺癌细胞，NCI-H838细胞
人肺鳞癌细胞 LTEP-s细胞
人小细胞肺癌细胞 LTEP-sm细胞
人肺鳞癌瘤株 LTEP-s细胞
人肺鳞癌细胞 NCI-H1703细胞
人肺鳞癌细胞 NCI-H2170细胞
人非小细胞肺癌细胞 NCI-H524细胞
人肺腺癌细胞 SPC-A1细胞
人肺癌细胞 A549细胞
人非小细胞肺癌细胞 H125细胞
人肺癌细胞 H1299细胞
人肺癌细胞 TKB-1细胞
人肺腺癌细胞，LTEP-a-2细胞
人肺腺癌细胞，Lu-165细胞
人大细胞肺癌细胞，NCI-H460细胞
人肺腺癌细胞，SPC-A-1细胞
人高转移肺癌细胞，095-D细胞
人肺鳞癌细胞，SK-MES-1细胞
人大细胞肺癌细胞，NCI-H661细胞
人肺黏液上皮样癌细胞，NCI-H292细胞
人肺退行性癌细胞，Calu-6细胞
人肺腺癌细胞，NCI-H1395细胞
人非小细胞肺癌细胞，NCI-H358细胞
人非小细胞肺癌细胞，HCC827细胞
人典型小细胞肺癌细胞，NCI-H1688细胞
人非小细胞肺癌细胞，NCI-H1299细胞
人胚肺二倍体细胞，2BS细胞
人支气管上皮样细胞，BEAS-2B细胞
人肺腺癌细胞 Calu-3细胞
人胚肺转化细胞 SL-1细胞
人支气管上皮样细胞 BEAS-2B细胞
人胚肺二倍体细胞 HEL-2细胞
人肺鳞癌细胞 NCI-H226细胞
人肺转化细胞系 AE1201细胞
人胚肺细胞系 KuMA细胞
人胚肺二倍体细胞 HEL-1细胞
人小细胞肺癌细胞 DMS 153细胞
人肺细胞 HLF-a细胞
人胚肺二倍体细胞 KMB-17细胞
人胚肺二倍体细胞 2BS细胞
人胚胎肺成纤维细胞 WI-38细胞
人胚胎气管组织来源细胞 CCC-HBE-2细胞
人胚肺成纤维细胞 CCC-HPF-1细胞
MRC-5细胞--MRC-5细胞 细胞株
人胚肺成纤维细胞 MRC-5细胞 细胞株
人小细胞肺癌细胞 NCI-H209细胞
人低分化肺腺癌细胞 GLC-82细胞
人小细胞肺癌细胞 NCI-H446细胞
人非小细胞肺腺癌细胞 NCI-H157细胞
人肺鳞癌细胞 NCI-H520细胞
人肺巨细胞癌高转移细胞株 PG-BE1细胞
人肺巨细胞癌低转移细胞株 PG-LH7细胞
人肺癌细胞 A-427细胞
人低分化肺腺癌细胞 SK-LU-1细胞
人肺支气管癌细胞 NCI-H1650细胞
人非小细胞肺腺癌细胞 NCI-H1975细胞

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