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NK细胞克隆的制备

ATCC细胞,传代细胞,BD培养基  基本原理

NK细胞克隆来源于NK细胞,该细胞的分离方法.这些NK细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK细胞克隆。

试剂和材料
植物血凝素（PHA）母液为100μg/ml重组IL－2（rIL－2）母液为105u/ml，分装小瓶（0．5ml/瓶),置－20℃长期保存，或置4℃下短期存放。应避免反复冻融，IL－2 不能用滤器过滤除菌处理。
培养基
1.接种培养液:RPMI1640＋10％FCS＋0.5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠。
2.饲养细胞培养液:RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠。
3.NK 克隆培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L谷氨酰胺＋100u/ml青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L丙酮酸钠,经0.2u 滤板过滤再加入100u/mlIL－2。
4.培养液：RPMI1640＋10％FCS。
饲养细胞：自体或同种异体PBMC
器皿和仪器：96 孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO2 孵箱、低温离心机、垂直气流超净台

实验操作
1.NK细胞的制备
制备NK.悬浮NK于接种培养液中,细胞浓度调至106/ml。
2.接种NK细胞
制备饲养细胞(PBMC),于4℃用300×g离心饲养细胞12min。被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调2×106/ml。
在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×108 个饲养细胞）。将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。
将NK 细胞悬浮于接种培养液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。
将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。
3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞）
从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106 细胞/ml）的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：
融化饲养细胞，移至50ml 试管中。轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。
按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。
4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。
5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。
6.分离克隆（11－15 天）
1） 当培养液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔，2 孔分为4 孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。
2）在96孔板上扩增克隆，并重复第7天的操作。