人肺退行性癌细胞，Calu-6细胞

更新时间：2015-07-16

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流式细胞仪流程：

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基本操作：
1:收集细胞：胰酶消化各孔（6孔板），收集到离心管，离心得沉淀；
2:用PBS打匀，洗1-2遍，离心，沉淀；
3:沉淀的细胞中加入500uL缓冲液，得悬液；
4:加5uL AnnexinV-FITC（细胞凋亡检测试剂盒）,混匀；
5:5uLPI混匀;(4)-(6)三组需要避光操作！
6:流式细胞仪测定。（4×105/孔，6孔板，2mL/孔）若第二天流式测量，可加5—10mL70%乙醇，在4℃固定8h以上。

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MTT溶液的配制：MTT浓度为5 mg/mL，溶于PBS或无酚红的培养基中，用0.22 um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

注：
在酶标仪检测结果时，为保证实验结果的线性，MTT吸光度在0-0.7范围；
MTT一般现用现配，过滤后4℃，避光保存2周有效，或保存在-20℃长期保存；避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋、锡箔纸包裹；一般把MTT粉分装在EP管，再现用现配，当MTT变为灰绿色时绝不能再用；

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MTT致癌，用时带透明薄膜手套。

制备细胞凋亡单染管：
活细胞
一半活细胞+一半死细胞（高温灭活-水浴90℃）+FITC（染色活Cell）
一半活细胞+一半死细胞+PI（PI-碘化丙啶染色核酸，但不能穿透细胞膜即染色死Cell）
一半活细胞+一半死细胞+FITC（碱性环境与抗体蛋白反应，主要是与赖氨酸的氨基与荧光素的硫碳胺键结合，形成FITC-蛋白质结合）+PI PBS的配制：(1000mL) NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g、 KH2PO4 0.2 g 、Na2HPO4.12H2O 2.9 g 加超纯水至1000mL高压蒸汽灭菌，4℃储存，备用。细胞器具清洗：瓶、管等+洁消精（过夜12 h），自来水冲洗25遍，蒸馏水冲1-2遍，蒸馏水泡过夜12 h,烘干，高压蒸汽灭菌（约2 h）,再烘干，至少2-3天，方可用。

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