传代细胞
在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒，从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结： 建议使用商品化的成熟毒载体系统(不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统)，从文献和我们多年的实践可以结论，这类系统是稳定的，因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上，这样会白花力气。 传代细胞至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素，只要在操作时按相关使用说明和操作步骤，应该没有大问题，所以也不要白花太多精力在这上面。 另一个需要重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节，是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失，或污染别的质粒或杂物?中抽纯化是否污染?是否抽提的是别的质粒?要养成同时做阴性对照的习惯(是否目的基因载体和阴性对照GFP载体是同一批，建议同一批，建议每次包装都如此操作)，如果这个环节没有啥问题，在构建中出现重组和缺失、或抽提纯化失败的可能性也不大。 传代细胞病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。 如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否)，细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是1000 个，腺相关病毒是10000 个)，所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒(72 小时)时细胞密度在90%‐95%左右。 落实了上面那些因素，那就是zui后一个原因。目的基因的大小、序列情况、该目的蛋白的功能毒性等导致无法包装成功(实践中，这种情况是有的，我们偶尔会遇到，可能原因是一些基因表达翻译后对包装细胞产生毒性，导致细胞状态异常)，那么我们能做的就是换病毒包装载体系统，尝试其他载体系统能否包装出来。不过这种情况出现的几率非常低，你做上100 个基因，也可能碰不上一个。 因而总的来说，我们进行病毒包装实验时要重视包装材料——细胞及表达质粒(对拿过来的细胞和载体系统要验证，常出现包装细胞、空表达载体质粒就有问题，我们要定期纯化生产包装细胞、空表达载体质粒)，细胞培养时让它“白白胖胖、活力充沛"，目的基因的表达载体构建纯化良好，质粒间比例得当，病毒包装实验还是能有较好的结果。 |
