人NK细胞克隆的制备

基本原理
NK 细胞克隆来源于NK 细胞，该细胞的分离方法参见*节之四。这些NK 细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK 细胞克隆。

NK细胞克隆的制备 实验操作
1.NK 细胞的制备
1） 制备NK的方法参见*章之第四节。
2） 悬浮NK于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。
2.接种NK细胞
1） 制备饲养细胞（PBMC）
2） 于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。
3） 被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。
4） 用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×106/ml。
5） 在6块96孔培养板的各孔中加100μl上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1.2×108 个饲养细胞）。
6） 将96孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。
7） 将NK细胞悬浮于接种培养液中，并于预温的96孔板中加入100μlNK细胞，使成为10细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。
8） 将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。
3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3天，主要依赖于饲养细胞）
1） 从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106细胞/ml）的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：
（1） 融化饲养细胞，移至50ml 试管中。
（2） 轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。
（3） 用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。
（4） 按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。
4.换液（6－8天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。
5.检测NK 细胞的生长状况（9－10天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。
6.分离克隆（11－15天）
1） 当培养液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96孔板上将生长的NK 按1 孔分为2孔，2孔分为4孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。
2） 在96 孔板上扩增克隆，并重复第7天的操作。

NK细胞克隆的制备 试剂和材料:
植物血凝素（PHA）母液为100μg/ml
重组IL－2（rIL－2）母液为105u/ml，分装小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃长期保存，或置4℃下短期存放。应避免反复冻融，IL－2 不能用滤器过滤除菌处理。

培养基:
1.接种培养液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
2.饲养细胞培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
3.NK 克隆培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠，经0．2u 滤板过滤再加入100u/ml IL－2。
4.培养液：RPMI1640＋10％FCS。
饲养细胞：自体或同种异体PBMC
器皿和仪器：96 孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO2 孵箱、低温离心机、垂直气流超净台

质控与提示
1.每天需检查细胞生长情况。
2.NK 细胞克隆只生长在96 孔板上，NK 细胞总是用96 孔培养板进行克隆培养。
3.目前了解，鼠NK 细胞克隆的制备于短期培养。