纤维细胞原代细胞株的培养实验

更新时间：2015-09-07

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　　原代细胞培养:是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。
　　
　　动物的选择:选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有zui大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
　　
　　每组小鼠胚胎1个
　　
　　实验材料：
　　
　　每组的超净台中有以下物品：
　　
　　1.50ml配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS)1瓶；100ml0.25%胰蛋白酶1瓶；PBS(-)1瓶
　　
　　2.100ml灭菌烧杯2个；
　　
　　3.50ml离心筒2个
　　
　　4.灭菌培养皿1个，细胞培养瓶1个,1ml，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个
　　
　　5.细胞计数板1块；
　　
　　6.灭好菌的镊子1把，剪刀1把；
　　
　　7.酒精灯1台；
　　
　　试验操作步骤：
　　
　　胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)
　　
　　采用认可的方案处死啮齿动物。立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。
　　
　　将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎，用PBS漂洗。在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml的无菌离心筒中,加入40ml0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动。在温暖的环境中或置于37°C培养箱中轻轻摇动15分钟。
　　
　　让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入lml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。
　　
　　加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。
　　
　　用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。