巨噬细胞培养
1.实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1ml（勿注入肠内）。
2.引颈杀死动物，手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3～5秒。
3.置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁。
4.再用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动。
5.用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内。
6.小心拔出针头，把液体注入离心管中，250g 4℃离心10分钟，去上清，加10 ml Eagle培养基。
7.计数细胞，每只小鼠可产生20～30×105细胞，其中90％为巨噬细胞。
8.为获取3×105个帖附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml。
9.为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1～2次后，再加新Eagle培养液置37℃ CO2温箱中培养。
巨噬细胞培养
一、原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞zui易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
二、操作步骤
冻存:
1.消化细胞（同实验二），将细胞悬液收集至离心管中。
2.1000rpm离心10分钟，弃上清液。
3.沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5×106/ml左右。
4.将悬液分至冻存管中，每管1 ml。
5.将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。
6.贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
7.按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。
注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
复苏:
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。
5、沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。
6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养，第二天观察生长情况。
试剂和器材:
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等
试剂：0.25％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）
附：冻存液配制：
培养基加入甘油或DSMO，使其终浓度达5—20%。保护剂的种类和用量视不同细胞而不同。配好后4℃下保存。
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