人胚胎干细胞，E1C4细胞

更新时间：2015-11-18

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甲基绿-派诺宁染色法

(一)原理
细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态，但两者发生机制不同。细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。

而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。根据这一特点，可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性，使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染，如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞，呈阴性染色者为坏死细胞。

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(二)试剂及配制
1. 组织固定液
无水乙醇 600ml
氯仿 300ml
冰醋酸 100ml
2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫。方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入氯仿20ml充分，使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把下沉带比红色的氯仿移去，再加入新的氯仿10ml，如此反复更换氯仿，直到无紫红色为止。该液作为贮存液，4℃保存。
3.染色液
甲基绿贮存液 5ml
5%派诺宁水溶液 1ml
蒸馏水 12ml
0.2mol/L乙酸钠(pH4.8) 18ml
临用前配制，滤纸过滤。
(三)操作方法
1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h(或培养细胞、细胞学甩片固定10min)。
2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
3.切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。(细胞学涂片不用梯度酒精)
4.置染色液中室温下染色约1h。
5.取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
6.插入丙酮中迅速分化。
7.转入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。
8.二甲苯透明2-3次。
9.中性树胶封固。
(四)结果
光学显微镜下凋亡细胞固缩，细胞核呈绿色或绿蓝色着染，胞质呈红紫色着染，坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染。观察时可用凋亡指数进行计数，即随机选择约10-20个视野(每张切片约1000-2500个细胞)，计数凋亡细胞百分率。

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