胚胎干细胞，E1C4细胞

人胚胎干细胞，E1C4细胞   细胞周期测定实验
细胞计数法：
实验方法原理 体外培养细胞 生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

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人胚胎干细胞，E1C4细胞  分裂指数指细胞 群体中分裂细胞 所占的百分比，它是测定细胞 周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 
实验材料 细胞  
试剂、试剂盒 胰酶 甲醇 培养液 冰醋酸 Giemsa染液  
仪器、耗材 CO2培养箱 普通显微镜 培养皿 盖玻片 吸管  
实验步骤 一、消化细胞 ，将细胞 悬液接至内含盖玻片的培养皿中。
二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。
三、取出盖片，按下列顺序操作：
PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 
四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。
五、计算
分裂指数=分裂细胞 数/总细胞 数×100%
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注意事项 1.  操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。
其他 一、Giemsa染液配制
称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。56℃中保温90-120分钟。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 
BrdU参入法
实验方法原理 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。
单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另一半为一深一浅。细胞如果仅经历了一个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的值。 
实验材料 细胞  
试剂、试剂盒 BrdU 甲醇 冰醋酸 Giemsa染液 秋水仙素 SSC 柠檬酸三钠 NaCl  
仪器、耗材 冰箱 玻片 水浴锅 锅盖 紫外灯 光学显微镜  
实验步骤 一、试剂配制
1.  BrdU配制
BrdU 10 mg加双蒸水10 ml ，4℃下避光保存。
2.  2×SSC配制
NaCl 1.75 g，柠檬酸三钠0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。
二、细胞生长至指数期时，向培养液中加入BrdU，使zui终浓度为10 μg/ml。 
三、44小时加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。
四、48小时后常规消化细胞至离心管中，注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。
五、常规染色体制片。
六、染色体玻片置56℃水浴锅盖上，铺上2×SSC 液，距紫外灯管6 cm处紫外照射30分钟。
七、弃去2×SSC液，流水冲洗。 
八、Giemsa液染色10分钟，流水冲洗，晾干。 
九、镜检100个分裂相，计*、二、三、四细胞期分裂指数。 

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