乳腺导管瘤细胞 BT-474细胞

cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以*条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。

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cDNA第二链的合成

1．将下列试剂直接加入大规模*链反应混合物中：
10 mmol/L MgCl2                                70μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4)                           5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）            10μl
1 mol/L (NH4)2SO4                               1.5μl
RNase H (1000单位/ml)                            1μl
大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml)            4.5μl
温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。
2．温育结束，将下列试剂加到反应混合物中：
β-NAD (50 mmol/L)                               1μl
大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml)            1μl
室温温育15min。
3．温育结束，加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合物室温温育15分钟。
4．取出3μl反应物，按步骤7和8描述的方法测定第二链DNA的质量。
5．将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中，用酚：氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3 mol/L(pH5.2)乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6．将下列试剂加到DNA溶液中：
10×T4多核苷酸激酶缓冲液                10μl
T4多核苷酸激酶（3000单位/ml）            1μl
室温温育15分钟。
7．测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，并按分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法测定1μl第二链合成产物中能被沉淀的放射性活度。
8．用下面公式计算第二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNA*链种的dNTP的量。
[第二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA第二链合成量/μg
x表示cDNA*链量。CDNA第二链合成量通常为*链量的70~80%
9．用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。
10．  Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
11．  加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15分钟，然后在微量离心机上以zui大速度4℃离心15分钟，回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查，是否所有放射性都沉淀下来。
12．  用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。
13．  小心吸出所有液体，空气干燥沉淀物。
14．  如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化，可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中。另外，如果要将cDNA直接与Not I或Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连，可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后，尽快进行cDNA合成的下一步骤。

乳腺导管瘤细胞 BT-474细胞? （1×T25培养瓶#密度75% 提供技术服务）
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