NCI-H1395细胞

cDNA文库不同于基因组文库，被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA开始，在此基础上，通过反转录酶作用产生一条与mRNA相互补的DNA链，然后除掉mRNA，以*条DNA链为模板复制出第二条DNA链（双链）；再进一步把此双链插入原核或真核载体。

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cDNA的甲基化

1．在cDNA样品中加入以下试剂：
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)                      5μl
5 mol/L NaCl                                2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                       2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨酸                    1μl
加H2O至                                  96μl
2．取出两小份样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为1号和2号，置于冰上。
3．在余下的反应混合液中加入2μl EcoR I 甲基化酶（80 000单位/ml），保存在0℃直至步骤4完成。
4．再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品（各2μl）至0.5ml微量离心管中，分别编为3号和4号。
5．在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。
6．所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。
7．于68℃加热15min，用酚：氯仿抽提大体积反应液一次，再用氯仿抽提一次。
8．在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇，混匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。
9．按下述方法分析4个小样对照反应：
a.     在每一对照反应中分别加入：
0.1 mol/L MgCl2                      2μl
10×EcoR I 缓冲液                    2μl
加H2O至                           20μl
b.     在2号和4号反应管中分别加入20单位EcoR I。
c.     四个对照样品于37℃温育1h，通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
10．  微量离心机以zui大速度离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。弃上清，加入200μl 70%乙醇洗涤沉淀，重复离心。
11．  用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇，在空气中晾干沉淀，然后将DNA溶于29μl TE（pH8.0）。
12．  尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。

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