293细胞人胚肾细胞

更新时间：2015-12-17

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SSR分子标记实验:

实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。

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3）玻璃板*干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE 51ml
40%丙烯酰胺 9ml
10%APS 400μl
TEMED 30μl
共计约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。

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2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至*条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。

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7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以*保存，也可以进行拍照记录。

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