细胞：HCC1395细胞 中文名称：人乳腺癌细胞 生长特性：贴壁细胞 培养基：1640培养基 血清：10%FBS（GIBCO胎牛血清） （网络信息主针对网络推广作用，仅供参考，细胞培养请咨询细胞库管理员，以细胞库管理员提供给您的信息为准，操作前，如果有不明白之处，先咨询细胞库管理员，避免不必要的损失；） 细胞常规培养传代流程（ 请严格遵照无菌操作） 1． 吸出原培养瓶中的培养基，PBS 缓冲液润洗细胞两次，加 2-3 ml 0.25% yi酶进行消化细胞（注意把握消化时间，通常控制在 1-2min） 2． 镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时（不建议消化到细胞漂浮）去掉yi酶，加 6~8ml 培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散。 3． 取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。 4． 注意培养基 PH 值变化情况，定期换液（每周 2-3 次），待细胞密度达到 80%以后重复 1 项操作或者冻存。
支气管炎病毒(AIBV)核酸检测 PCR扩增： 从取出AIBV-PCR MIX、Taq酶系，逆转录酶系室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。 设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），测试反应体系配制如下表： 试剂:AIBV-PCR MIX（20μl）逆转录酶系（1μl）Taq酶系（1μl）
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入22μl，向每管中加入处理后样品(所获得的RNA样品)或AIBV阳性质控品和阴性质控品3μl，10,000rpm瞬时离心30秒。 将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品，阳性质控品以及未知标本，并设置反应体积(25μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件: ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件: 42℃→20分钟，后94℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒， 40个循环。 LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件: 42℃→20分钟，94℃→2分钟，后93℃ 5秒→58℃ 45秒，共40个循环。
结果分析判定： 反应结束后，使用手动调整阈值使阴性质控品Ct 值在40以上，Ct 值小于38个循环的为阳性；Ct 值在38-40个循环之间，为灰区，需要进行重复试验。重复试验之后，如果Ct 值仍然在38-40个循环之间，判断为阳性，没有荧光值增长为阴性。 【质控标准】 阴性质控品：全部阴性。 AIBV阳性质控品：阳性质控品的 Ct 值均应小于 30，且呈标准S型扩增曲线。 以上条件应同时满足 ，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。
|
