细胞：CMT-167细胞 中文名称：小鼠肺癌细胞 生长特性：贴壁 培养基：DMEM-H +10%FBS（GIBCO胎牛血清） 冻存条件：50%基础培养基、40% FBS、10% DMSO 收到细胞后请尽快更换配套培养基，或自己配置的新鲜培养基（含15%血清），如因特殊情况需要继续使用原瓶培养基，请在原瓶培养基中额外添加10%的血清（原瓶培养基的继续使用时间最长不宜超过72小时）。 CMT-167细胞传代： 1）：细胞密度约80%时，吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2~3 ml 0.25% yi酶进行消化细胞（注意根据实际情况，把握消化时间）。 2）：镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时； （可用吸管吸起些许yi酶轻轻吹打细胞层某处，即可肉眼可见细胞层脱落，或吹打后镜下观察吹打处，即消化完成，否则继续消化） 直接吸掉yi酶，加3~4ml 培养基，轻轻吹打细胞层，把细胞层吹落，吹散。 3）：取部分细胞悬液转移到新的培养皿中，添加适当的培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养。 4）：注意培养基PH值变化情况，定期换液（每周2-3次），待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存。 （网络信息主针对网络推广作用，仅供参考，细胞培养请咨询细胞库管理员，以细胞库管理员提供给您的信息为准，操作前，如果有不明白之处，先咨询细胞库管理员，避免不必要的损失；） 犬瘟热病毒(CDV)核酸检测 逆转录： 根据标本数取200μl DEPC水处理的PCR反应管，取出CDV RT MIX室温溶解充分混匀，向反应管中每管加入7μl CDV RT MIX，1μl逆转录酶系(使用前请10,000rpm瞬时离心30s)， 以及2μl 上述获得的RNA。 1,0000rpm瞬时离心30秒，将各反应管放入PCR仪器的反应槽内，在PCR仪上进行以下循环：30℃ 5分钟，42℃30分钟后98℃5分钟灭活逆转录酶。
犬瘟热病毒(CDV)核酸检测 PCR扩增： 取出CDV–PCR MIX、Taq酶系，室温融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+4管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表： （CDV–PCR MIX 24μl）（Taq酶系 2μl） 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入26μl，向每管中加入处理后样品(所获得的DNA样品)或CDV阳性质控品(107Copies/ml) (使用前用阴性质控品梯度稀释10倍、100倍、1000倍，记为1×10P6PCopies/ml，1×10P5PCopies/ml，1×10P4PCopies/ml)和阴性质控品4μl，10,000rpm瞬时离心30秒。 将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，按对应顺序设置阴性控品，阳性定量标准品以及未知标本，并设置反应体积(30μl)、样品名称、标记荧光基团种类(报告基团为FAM，淬灭基团为TAMRA)和循环条件: ABI PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI PRISM 7000 (需要剪掉反应盖)，ABI PRISM7300/7500(使用8联管)，MJ Opticon(使用8联管)等使用薄壁管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 30秒→55℃ 45秒，40个循环。 LightCycler等使用毛细管的仪器，循环条件：94℃→2分钟，后93℃ 5秒→56℃ 45秒，共40个循环。
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