人胚肺成纤维细胞MRC-5 细胞 RNA提取实验方法流程 1、实验目的 提取人体细胞的总RNA和mRNA。 2、本实验所需试剂 1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件， 2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂， 3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管, 4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇， 5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。 6）、新配的电泳缓冲液，专跑RNA的琼脂糖（Agarose）。 人胚肺成纤维细胞MRC-5 细胞 RNA提取实验方法流程3、实验流程（掌握内容） 3.1 细胞总RNA的提取 1）、6孔板细胞（CNE-2）汇合度为90-100%时，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂（Gibco公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。 2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。 3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟。 4）、12000 rpm，10分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。 5）、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟， DEPC处理水20-30 ul加入，中枪打匀，55-人胚肺成纤维细胞MRC-5 细胞 RNA提取实验方法流程60℃水浴10分钟溶解总RNA，测OD值。 6）、电泳。 3.2 从总RNA中分离mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN） 1）、取上述提取的总RNA若干（少于0.25 mg）到一个新的无RNase 的EP管中，用无RNase的水定容到250 ul。 2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打匀或用手弹匀。 3）、70℃水浴，3分钟（裂解RNA的二级结构）。 4）、20-30℃条件下，静置10分钟（让Oligotex与mRNA结合）。 5）、高速离心2分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约50 ul的上清在原管里。 6）、用Buffer OW2 400 ul重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1分钟。 7）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速离心1分钟，丢掉滤过液。 8）、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100 ul热的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1分钟。 9）、为保证zui大的 mRNA产量，可再次重复第8步。 10）、电泳。 4、mRNA的应用（了解内容）： RT-PCR, Northern杂交，cDNA文库构建, mRNA末端快速扩增（RACE），差异表达（DDRT-PCR），引物延伸反应（Primer Extension），体外转录（In Vitro RNA Transcription）, RNA标记（RNA labeling），RNA酶保护试验（RNase and S1 Nuclease Protection Assay），RNA微注射（RNA Microinjection） 人胚肺成纤维细胞MRC-5 人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1 人胚胎气管组织来源细胞CCC-HBE-2 人胚胎肺成纤维细胞WI-38 SV-40Z转化肺成纤维细胞WI38/VA13 人胚肺二倍体细胞2BS 人胚肺二倍体细胞KMB-17 人肺细胞HLF-a 人小细胞肺癌细胞DMS 153 人胚肺细胞 VA13细胞WI-38 VA13亚系 2RA 人胚肺二倍体细胞HEL-1 人胚肺细胞系KuMA 人肺转化细胞系AE1201 人肺鳞癌细胞NCI-H226 人胚肺二倍体细胞HEL-2 人支气管上皮样细胞BEAS-2B 人胚肺转化细胞SL-1 人肺腺癌细胞Calu-3 人小细胞肺癌细胞NCI-H209 人低分化肺腺癌细胞GLC-82 人小细胞肺癌细胞NCI-H446 人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H157 人肺鳞癌细胞NCI-H520 人肺巨细胞癌高转移细胞株PG-BE1 人肺巨细胞癌低转移细胞株PG-LH |
