人胰腺腺泡上皮癌HPAC细胞 微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量 【实验原理】 蛋白质（或其它含氮有机化合物）与浓H2SO4共热时，其中碳、氢两种元素被氧化成CO2和H2O，而氮元素转变成NH3，并进一步与H2SO4反应生成（NH4）2SO4，残留于消化液中，该过程通常称为“消化”。以甘氨酸为例： CH2NH2COOH + 3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 2NH3 + H2SO4 → （NH4）2SO4 但是，该反应进行得很缓慢，消化费时较长，通常需加入K2SO4或Na2SO4以提高反应液的沸点，并加入CuSO4作为催化剂，以加速反应的进行；氧化剂H2O2也能加速反应。消化完毕后，加入过量浓碱（如NaOH）使消化液中的（NH4）2SO4分解放出NH3，以蒸馏法借水蒸汽蒸出的NH3，用一定量、一定浓度的H3BO3溶液吸收。NH3与酸溶液中H+结合成NH4+，使溶液中的H+浓度降低，然后用标准强酸（如盐酸）滴定，直至恢复溶液中原来的H+浓度为止。 （NH4）2SO4? +? NaOH → Na2SO4 + 2 NH4OH NH4OH? → NH3? + ?H2O 3NH3 + H3BO3 → 3 NH4+ + BO33－ BO33－ + 3H+ → H3BO3 zui后根据所用标准酸的量计算出样品中的含氮量。大多数蛋白质的含氮量平均为16%，所以将测得的蛋白质的含氮量乘以蛋白质系数6.25（即每含氮1g，就表示该物质含蛋白质6.25g），即可计算出蛋白质的含量。 人胰腺腺泡上皮癌HPAC细胞 微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量【器材和试剂】 （一）器材 1. 100ml凯氏烧瓶 2. 改进型凯氏定氮仪 3. 50ml容量瓶 4. 分析天平（电子天平） 5. 烘箱 6. 电炉 7. 酒精灯 8. 小玻璃珠 9. 滴定管 10. 洗瓶 11. 锥形瓶 12. 铁架台 13. 普通面粉或其它样品 （二） 试剂 1. 消化液 30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O =3∶2∶1 2. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液 4. 混合催化剂（粉末K2SO4- CuSO4混合物） K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。 5. ?0.01mol/L标准盐酸溶液 6. 混合指示剂（田氏指氏剂） 取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。 7. 蒸馏水 人胰腺腺泡上皮癌HPAC细胞 微量凯氏（Micro-Kjeldahl）定氮法测定蛋白质含量【实验步骤】 （一） 改进凯氏定氮仪的构造和安装 改进型凯氏定氮仪由蒸汽发生器、反应室及冷凝器三部分组成。蒸馏装置的结构如图所示，可分成三部分来叙述： 1. 蒸汽发生器和反应室：蒸汽发生器有3个开口（图中的3、4、5）；反应室有1个开口（图中的6）。 2. 冷凝器和通气室：冷凝器有2个开口（图中的9、10）；通气室有2个开口（图中的12、13）。 3. 排水柱： 排水柱有3个开口（图中的15、16、17）。 安装时，按图的连接方式仔细安装在一平稳的实验台上。先将主体部分固定在铁架台上，其底部放上电炉或酒精灯。然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连接，并夹上自由夹。zui后长橡胶管连接进水口10和出水口17。 |
