中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞培养基本技术概述 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminar flow） 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞培养基本技术概述4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网（300 小时/预滤网,3000 小时/HEPA）。 6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene （PP） 为不透明材质，polystyrene （PS） 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于oven 中烘干。 3.2. 实验用玻璃pasteur pipet 以干热灭菌170 oC, 4 小时。 3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高压灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟处理。 中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞培养基本技术概述培养基 1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。 2. 液体培养基（加血清） 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。 3. 粉末培养基配制（以1 升为例）： 3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸（HCl）或强碱（NaOH），因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 3.2. 材料： 3.2.1. 纯水（milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要） 3.2.2. 粉末培养基 3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019） 3.2.4. 电磁搅拌器 3.2.5. 无菌血清瓶 3.2.6. 0.1 或0.2 mm无菌过滤膜 3.2.7. pH meter 3.2.8. 真空帮浦 3.2.9. CO2 气体 3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末（数量依培养基种类而异，表一）溶于200mlmilli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。 3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后 溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。 若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 oC。（血清亦可加入培养基中一起过滤） 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 4. 配制培养基之生长测试 4.1. 材料： 4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish） 4.1.3. methanol 4.1.4. glacial acetic acid 4.1.5. 10 % Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013） 中国仓鼠卵巢细胞CHO 中国仓鼠卵巢细胞 K1（亚系克隆）CHO-K1 中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhFr 仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷CHO/dhFr- 中国仓鼠卵巢细胞CTLA4 Ig-24 牛胚气管细胞EBTr （NBL-4） 仓鼠卵巢细胞Lec1 鸡胚成纤维细胞UMNSAH/DF-1 豚鼠胚胎细胞104C1 中国仓鼠卵巢细胞7WCY1.0 中国仓鼠卵巢细胞7WD10 中国仓鼠卵巢细胞7WML6.0 中国仓鼠卵巢细胞7WPS1 小鼠睾丸间质细胞TM3 正常小鼠睾丸 Sertoli细胞TM4 昆虫卵巢细胞SF9 猪胎睾丸传代细胞ST 中国仓鼠卵巢细胞（亚系克隆）CHO-HCV-C 兴国鲤尾鳍细胞XGL 猴脉络膜-视网膜（内皮）细胞RF/6A 新生牛眼晶体上皮细胞NBLE 新生牛眼 Tenon's囊成纤维细胞NBTF 鼠舌黏膜鳞癌细胞Rca-T 鼠颊黏膜鳞癌细胞Rca-B 幼蚊细胞C6/36 大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 大鼠气管上皮细胞RTE 大鼠肺成纤维样细胞RL1 大鼠肺细胞WTRL1 大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7r5 大鼠心肌细胞H9c2（2-1） 大鼠肝细胞瘤H-4-Ⅱ-E 大鼠肝细胞IAR20 大鼠肝细胞瘤H4-Ⅱ-E-C3 大鼠肝细胞BRL 大鼠肝细胞BRL 3A 大鼠肝癌细胞RH-35 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12 正常大鼠肾细胞NRK 大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1 大鼠肾细胞RK1 大鼠肾细胞NRK-52E 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（低分化）PC-12 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（高分化）PC-12 |
