科研抗体 胶体金标记蛋白A技术 PAg复合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都极少发生非特异性的交互作用，蛋白A和金粒间非共价的结合特性既不影响蛋白A的活性，又能保持高度的稳定性，PAg复合物分子zui小易于穿透组织。PAg复合物的原液在4℃可保存达一年之久。电镜水平的PAg染色法 PAg法在电镜技术的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：①须1%卵白蛋白－PBs （pH7.4）或1%卵白蛋白—0.05mol/l Tris缓冲液（pH7.4）来封闭非特异性的结合部位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清，因为PAg复合物能够与正常血清组中的Ig结合，从而给出假阳性结果；②在应用*抗血清孵育和PBS冲洗后作第二抗血清即PAg复合物孵育前的准备时，应用的PBS或TBS的pH应变更为pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。 液体配制： 科研抗体 胶体金标记蛋白A技术1、胶体金稀释液配方： （PH＝8.2）的0.02mo1／L Tris TBS缓冲液，加入试剂级卵清白蛋白至1％。｛免疫电镜按1：20-50稀释，淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使用，未用完的应该丢弃。（免疫胶体金说明书）｝ 2、清洗液： 0.5mol／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液：Tris，60.57g，1mol／L Hcl约420m1，调pH值至7.4，zui后加双蒸水至1000m1，此为储备液。 0.05mo1／L Tris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液100m1；加双蒸水至1000m1，调pH值至7.4。 0.02mo1／LTris缓冲生理盐水：氯化钠8.5-9g；o.5mo1／L，pH7.4 Tris-Hcl缓冲液40m1，加双蒸水至l000m1，调pH值至8.2。 3、H2O2的配制:3% H2O2 4、8％过碘酸钠水溶液 5、封闭液： 前封闭液：1%卵白蛋白—0.05mo1／LTris缓冲液（pH7.4）； 后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白—0.02mo1／LTris缓冲液（pH8.2），后封闭为胶体金结合作准备。 具体操作: 一、包埋： 常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时70％的丙酮中没有添加染色剂。样品于37度烘箱中固化。 二、切片： 超薄切片厚50～70nm左右，载于300网孔的镍网上。 抗原修复： 科研抗体 胶体金标记蛋白A技术1、置1%H2O2内10min至1h（视树脂的硬度和切片的厚度而定），以去锇酸和增进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。对中枢神经系统切片，有主张以1%过碘酸钾（KIO4）代替H2O2的。 （同时用8％过碘酸钠水溶液代替双氧水，室温5～25分钟以及丙酮对环氧树脂进行溶解。看三者那个效果） 2、双蒸水洗3次，每次10min，第1，2次浮于液滴上清洗，第3次以盛双蒸水的注射器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强，用滤纸在网缘将水吸干。（0.05mo1／L TBS pH7.4洗5min×3次?） 三、封闭以及免疫反应： 1、载有超薄片的镍网或金网浮于1%卵白蛋白－TBS（7.4）液滴上，室温约1h，阻断非特异性吸附，吸去多余血清，不洗。 2、载网直接移至*抗血清液滴上（抗体稀释度较常规免疫组化低l倍），在室温孵育2h或4℃18～24h。 3、0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。0.02mo1／L TBS PH8.2，洗5min×3次。1％卵清白蛋白0.02mo1／L TBS（8.2） 37℃孵育l h，再次阻断非特异性吸附，吸去多余液体，不洗。 4、将PAg原液稀释10～20倍（1：30～1：100，淡红色为适宜稀释液），载网浮于该液滴上，室温孵育10min至1h（37℃孵育2h？）。 5、0.02mo1／L TBS pH8.2，洗5min×3次。0.05mo1／L TBS pH7.4，洗5min×3次。zui后切片浸于0.05m01／L TBS pH7.4缓冲液中，送电镜室处理（含2%戊二醛及3%多聚甲醛的TBS液固定30分钟？）。 |
