PCR 技术 ATCC细胞 [实验目的] 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。 [实验原理] 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 1．变性：加热 使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全，即退火阶段。 3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’→3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。 典型的RCP反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。 [实验仪器与设备] 1．PCR基因扩增仪 2．琼脂糖凝胶电泳系统 [实验材料] 1. DNA模板 2. 4种dNTP 3. 引物1和引物2 4. Taq酶 5. 琼脂糖 6. DNA Marker 7. tip 8.eppendorf管 9. 微量移液器 附试剂的配制： 1. 10×PCR缓冲液 500mmol/L KCl PCR 技术 ATCC细胞100mmol/L Tris·HCl（Ph8.3,室温） 15mmol/L MgCl2 0.1% 明胶 2. 4×dNTP 10mmol/L dATP 10mmol/L dCTP 10mmol/L dGTP 10mmol/L dTTP 3. Taq酶 1u/μL 4. DNA模板 1ng/μL 5. 引物溶液浓度 10pmol/μL [实验步骤] 1．在0.5ml Eppendorf管内配制25μL反应体系 反应物 体积/μL ddH2O 11 10×PCR缓冲液 2.5 2.5mmol/L dNTP 2.0 25mmol/L MgCl2 1.5 引物1 1.0 引物2 1.0 模板DNA 5PCR 技术 ATCC细胞 Taq酶 1 混匀,加25μL石蜡油. 2.按下述程序进行扩增 ① 94℃预变性 5min ② 94℃变性 1min ③ 52℃退火 1min ④ 72℃延伸 1min ⑤ 重复步骤②-④35次 ⑥ 72℃终延伸 10min 3．琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果 配制1.5%琼脂糖凝胶，取10μL扩增产物电泳。保持电流40mA.电泳结束后，用EB染色15min,紫外灯下观察结果。 |
