菌种 大肠杆菌实验 实验方法原理 质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 实验材料质粒DNA重组DNA 试剂、试剂盒LB培养基蒸馏水IPTGX-gal氨苄青霉素 仪器、耗材旋涡混合器微量移液取样器移液器吸头 离心管双面微量离心管架干式恒温气浴恒温水浴锅制冰机恒温摇床培养皿超净工作台酒精灯玻璃涂棒恒温培养箱 实验步骤 一、实验材料准备 菌种 大肠杆菌实验1. 器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。 2. 试剂 培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。 3. 材料处理 无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。 二、操作步骤 菌种 大肠杆菌实验1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。 2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。 3. 加入5 μl 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。 4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。 5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。 6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。 8. 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。 9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 10. 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。 注意事项 1. 玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。 |
