抗体水平测定法

1．本次实验的目的和要求
掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理
    某些病毒（如新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象（HA）。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验（HI）。
3．需用的仪器或试剂等
动物 健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清
4．实验步骤
（1）发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
 （2）诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：
 3.鸡新城疫（ND）的HA和HI
（1）试验准备  
 ① 抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
 ② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管（按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂）内，迅速混匀。如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内（保存液2份，血液1份）于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液（生理盐水）洗涤。再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将zui后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液（0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液）。
 ③ 被检血清：将被检鸡群编号登记，用消毒过的干燥注射器采血，注入洁净干燥试管内（微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血），在室温中静置或离心，待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器，严禁交叉使用。
④ 稀释液：为灭菌的生理盐水。
⑤ 红细胞保存液的配制方法：葡萄糖2.05克，柠檬酸钠（SHOO）0.80克，柠檬酸（2H20）0.055克，氯化钠0.42克，蒸馏水加至100毫升。过滤分装，高压灭菌10分钟，放4℃冰箱保存。
（2）红细胞凝集试验（HA）   主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。
鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法，以u或v形微孔塑料板代替试管。
① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴（0.05毫升）。
② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升，加入*孔，反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第二孔，在第二孔反复抽动6次后，吸出0.05毫升加入第三孔，如此连续稀释至第十一孔后吸出0.05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。

人胎儿胸腺细胞株HFT-8810  
人前列腺上皮细胞RWPE-1  
人前列腺正常细胞RWPE-2  
人男性正常龟头细胞Hs68  
人整合 SV40基因的乳腺上皮细胞HBL-100  
人前列腺癌细胞DU 145  
人乳腺癌细胞MDA-MB-231  
人前列腺癌细胞LNCaP  
人乳腺癌细胞MCF 7B  
人乳腺癌细胞MDA-MB-157  
人乳腺导管癌细胞ZR-75-1  
人乳腺导管瘤细胞UACC812  
人前列腺癌高转移细胞株PC-3M-IE8  
人前列腺癌低转移细胞株PC-3M-2B4  
人乳腺导管癌细胞HCC38  
人乳腺导管癌细胞ZR-75-30  
人乳腺癌瘤株MCF7  
人乳腺癌细胞BT-20  
人乳腺导管癌细胞BT-549  
人乳腺导管癌细胞MDA-MB-175Ⅶ  
人乳腺癌细胞MDA-MB-415  
人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435  
人乳腺癌细胞MDA-MB-436  
人乳腺癌细胞Bcap-37  
人前列腺癌细胞LNCaP clone FGC  
人乳腺癌细胞MDA-MB-453  
人乳腺癌细胞MDA-MB-435S  
人乳腺癌细胞SK-BR-3  
人髓状甲状腺肿瘤细胞TT  
人乳腺导管癌细胞T47D  
人乳腺癌细胞BT-549  
人前列腺癌细胞22Rv1  

人红白细胞白血病细胞HEL细胞 （冻存、复苏）
人乳腺癌细胞MDA-MB-468  
人甲状腺鳞癌细胞SW579  
人乳腺癌细胞Hs 578T  
人乳腺癌细胞MDA-MB-468-06  
人乳腺导管瘤细胞BT-474  
人乳腺癌细胞HCC1937  
人前列腺癌细胞PC-3  
人乳腺癌细胞ZR-75-30  
人乳腺癌细胞MCF7  
人乳腺癌细胞BC－009  
人乳腺癌细胞BC－019  
人乳腺癌细胞BC－020  
人乳腺癌细胞BC－021  
人乳腺癌细胞BC－022  

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细胞介绍：

细胞名称      小鼠胚胎成纤维细胞；3T3-Swiss albino
形态特性       成纤维细胞样
生长特性      贴壁生长
特征特性       3T3细胞株是1962年Todaro G和Green H从分离的瑞士小鼠胚胎中建立的；该细胞的生长受接触性抑制，汇合状态的单层细胞密度为40000个细胞/平方厘米；检测结果显示该细胞鼠痘病毒阴性；在塑料瓶中生长较好，在某些玻璃表面上可能状态不佳；细胞生长饱和时其密度可以达到约50000 cells/cm2。
培养条件       DMEM-H: Dulbecco's Modified Eagle's Medium （DME H-21 4.5g/Liter Glucose）  10%FBS
传代方法       1:3传代；3~4天1次。
传代情况      C5
冻存条件       基础培养基+5%DMSO+20%FBS
支原体检测      培养法（-）