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| PG-LH7细胞 PG-LH7细胞株 |
| 点击次数：1776 更新时间：2016-01-06 |
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DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤
修饰设计：使用CpGenomeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。
细胞库细胞种类齐全，上信息发布数量有限，为了能及时快速确认您所需要的细胞是否提供，请*时间细胞库管理员。
试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNAzui终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。
*步：试剂准备
（1）3MNaOH原料（用前现配）
把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
（2）20mMNaOH/90%EtOH（用前现配）
配制1mL该溶液需：900μl100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl3M的氢氧化钠。
（3）溶解试剂Ⅰ（用前现配）
打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227gDNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl3MNaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了效果，试剂应在配置后立即使用。
（4）溶解试剂Ⅱ
打开前将试剂瓶加温至室温。将1μlβ-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35gDNA修饰Ⅱ。充分混合确保*溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。
第二步：DNA修饰程序
1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl3MNaOH加入到含有1.0μgDNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。
注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2μlDNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl3MNaOH并混匀。
2、50℃DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
3、加入550μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。CR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。
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