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乳酸菌菌种的分离筛选方法  

乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。ATCC细胞,传代细胞

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。  

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。  

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿 酵母膏 油酸 吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。  

筛选方法： 
溶钙圈法：  利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 
其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。 

葡萄糖20g/L 酵母膏10g/L PH6.0-6.5  

蛋白胨 8- 10 g/L 酵母膏 3- 5g/L 葡萄糖13- 15g/L KH2PO4 1.5- 2.0g/L MgSO4 0.3-0.5 g/L  MnSO4 0.2-0.25g/L  NaAC 3.0-5.0g/L   PH 5.5-6.5 

蛋白胨 0.8- 1.0g/L 糖蜜 3.0-5.0g/L 酵母膏 3-5g/L 玉米浆0.5- 1.0g/L KH2PO4 0.1- 0.3g/L MgSO4  0.3-0.5g/L NaC13-5g/L 葡萄糖 8-10g/L PH5.5-6.5（发酵或种子培养基） 

MRS培养基 （分离培养计数用）  
蛋白胨 10.0g、牛肉膏 10.0g、 酵母膏 5.0g、 柠檬酸氢二铵 2.0g、 葡萄糖 20.0g、 吐温 80 1.0mL、 乙酸钠 5.0g、 磷酸氢二钾 2.0g、硫酸镁 0.58g、硫酸锰 0.25g、琼脂 18.0g、 蒸馏水1L,   pH 6.5。（分离培养基），

当MRS培养基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙, 充分混匀,倒平板。 1.8 BCP培养基（溴甲酚紫培养基）  乳糖5.0g  蛋白胨 5.0g 酵母膏 3.0g   0.5℅溴甲酚紫10ml 自来水1000ml  pH6.5-7.0              （分离用）  

BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒精溶液0.07ml，0.075Mpa 20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏 1.0g 溶解后调pH6.5-6.8，0.1 Mpa 20min.趁热在无菌操作下两者混合均匀， 倒平板，37℃培养24h，检查是否有杂菌。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养  
48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

溴甲酚绿指示剂法：  

培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）  
筛选过程：同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。 

菌种的分离筛选 1.培养基：  

麦芽汁碳酸钙培养基：
麦芽汁（10BX）1L  预先灭菌碳酸钙5-10g/L  PH自然 （分离用）  

牛肉膏 10g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 10g/L 番茄汁200g/L  葡萄糖 10g/L 吐温0.05%  CaCO315-20g/L  溴甲酚绿 0.01%   PH6.0-6.5（分离用）
 
番茄汁碳酸钙培养基：酵母膏7.5g/L 葡萄糖10g/L 番茄汁100mL 蛋白胨7.5g/L KH2PO4 2.0 g/L 吐温0.5mL  PH6.0-6.5     （分离用）