人NK 细胞克隆的制备

基本原理
NK 细胞克隆来源于NK 细胞，该细胞的分离方法参见*节之四。这些NK 细胞与经γ射线照射的饲养细胞苓而获得的NK 细胞克隆。

试剂和材料
● 植物血凝素（PHA）母液为100μg/ml
● 重组IL－2（rIL－2）母液为105u/ml，分装小瓶（0．5ml/瓶），置－20℃长期保存，或置4℃下短期存放。应避免反复冻融，IL－2 不能用滤器过滤除菌处理。
● 培养基
1.接种培养液：RPMI1640＋10％FCS＋0．5μg/ml PHA＋200u/ml IL－2＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
2.饲养细胞培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠。
3.NK 克隆培养液：RPMI1640＋10％FCS＋10g/L 谷氨酰胺＋100u/ml 青霉素＋100μg/ml 链霉素＋1mmol/L 丙酮酸钠，经0．2u 滤板过滤再加入100u/ml IL－2。
4.培养液：RPMI1640＋10％FCS。
● 饲养细胞：自体或同种异体PBMC
● 器皿和仪器：96 孔细胞培养板、多头移液管、微量移液管、倒置显微镜、CO2 孵箱、低温离心机、垂直气流超净台

实验操作
1.NK 细胞的制备
1） 制备NK 的方法参见*章之第四节。
2） 悬浮NK 于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。
2.接种NK 细胞
1） 制备饲养细胞（PBMC）方法参见*章*节。

人小细胞肺癌细胞DMS 153  
人胚肺细胞 VA13细胞WI-38 VA13亚系 2RA  
人胚肺二倍体细胞HEL-1  
人胚肺细胞系KuMA  
人肺转化细胞系AE1201    
人肺鳞癌细胞NCI-H226  
人胚肺二倍体细胞HEL-2  
人支气管上皮样细胞BEAS-2B  
人胚肺转化细胞SL-1  
人肺腺癌细胞Calu-3  
人小细胞肺癌细胞NCI-H209  
人低分化肺腺癌细胞GLC-82  
人小细胞肺癌细胞NCI-H446  
人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H157  
人肺鳞癌细胞NCI-H520  
人肺巨细胞癌高转移细胞株PG-BE1  
人肺巨细胞癌低转移细胞株PG-LH7  
人肺癌细胞A-427  
人低分化肺腺癌细胞SK-LU-1  
人肺支气管癌细胞NCI-H1650  
人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H1975  
人非小细胞肺腺癌细胞NCI-H2087  
人小细胞肺癌细胞NCI-H2227  
人非小细胞肺癌细胞NCI-H23  
人肺腺鳞癌细胞NCI-H596  
人非小细胞肺癌细胞NCI-H838 

2） 于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。
3） 被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。
4） 用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×106/ml。
5） 在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×108 个饲养细胞）。
6） 将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。
7） 将NK 细胞悬浮于接种培养液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。
8） 将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。
3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞）
1） 从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。
2） 每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106 细胞/ml）的NK 克隆培养液100μl。此培养液的制备方法如下：
（1） 融化饲养细胞，移至50ml 试管中。
（2） 轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。
（3） 用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。
（4） 按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。
4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。
5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。
6.分离克隆（11－15 天）
1） 当培养液颜色变黄时，证明细胞已生长，在96 孔板上将生长的NK 按1 孔分为2 孔，2 孔分为4 孔，4 孔分为8 孔的方式分离克隆培养。
2） 在96 孔板上扩增克隆，并重复第7 天的操作。

人非小细胞肺癌细胞H125  
人肺癌细胞H1299  
人肺癌细胞TKB-1  
人肺腺癌细胞LTEP-a-2  
人肺腺癌细胞Lu-165  
人大细胞肺癌细胞NCI-H460  
人肺腺癌细胞SPC-A-1  
人高转移肺癌细胞095-D  
人肺鳞癌细胞SK-MES-1  
人大细胞肺癌细胞NCI-H661  
人肺黏液上皮样癌细胞NCI-H292  
人肺退行性癌细胞Calu-6  
人肺腺癌细胞NCI-H1395  
人非小细胞肺癌细胞NCI-H358  
人非小细胞肺癌细胞HCC827  
人典型小细胞肺癌细胞NCI-H1688  
人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299  
人胚肺二倍体细胞2BS  
人支气管上皮样细胞BEAS-2B  
人胚肺成纤维细胞CCC-HPF-1  
人胚胎气管组织来源细胞CCC-HBE-2  
人肺腺癌细胞Calu-3  
人肺退行性癌细胞Calu-6  
人小细胞肺癌细胞DMS 153  
人高转移肺癌细胞95-D  
人低分化肺腺癌细胞GLC-82  
人肺细胞HLF-a  

质控与提示
1.每天需检查细胞生长情况。
2.NK 细胞克隆只生长在96 孔板上，NK 细胞总是用96 孔培养板进行克隆培养。
3.目前了解，鼠NK 细胞克隆的制备于短期培养。